El microscopio electrónico de transmisión (TEM) es un instrumento que aprovecha los fenómenos físico-atómicos que se producen cuando un haz de electrones suficientemente acelerado colisiona con una muestra delgada convenientemente preparada. Cuando los electrones colisionan con la muestra, en función de su grosor y del tipo de átomos que la forman, parte de ellos son dispersados selectivamente, es decir, hay una gradación entre los electrones que la atraviesan directamente y los que son totalmente desviados. Todos ellos son conducidos y modulados por unas lentes para formar una imagen final sobre una CCD que puede tener miles de aumentos con una definición inalcanzable para cualquier otro instrumento. La información que se obtiene es una imagen con distintas intensidades de gris que se corresponden al grado de dispersión de los electrones incidentes.

La imagen del TEM tal como se ha descrito ofrece información sobre la estructura de la muestra, tanto si ésta es amorfa o cristalina.

Además, si la muestra es cristalina, es decir, hay una estructura de planos periódica, puede ocurrir que varias familias de esos planos cumplan la condición de Bragg y difracten de forma coherente la onda electrónica incidente. Esto da lugar a un diagrama de difracción, que es una imagen de distintos puntos ordenados respecto a un punto central (electrones transmitidos no desviados) que nos aportan información sobre la orientación y estructura del/los cristales presentes.

Las muestras destinadas al SEM han de cumplir dos condiciones: deben estar secas y ser conductoras. El proceso de secado ha de llevarse a cabo preservando al máximo la estructura original de la muestra. Para ello tenemos dos alternativas: usar el método clásico de fijación y deshidratación química que el usuario realiza en su laboratorio y que finaliza con el secado por punto crítico en nuestras instalaciones, o utilizar el moderno método de fijación física por criofijación que ya está acoplado a uno de los microscopios.

En ambos casos la muestra necesita recubrirse después con un material que la haga conductora y permita su observación en el microscopio.

Recubrimiento de muestras en bajo vacío

Con este método se realizan dos tipos de recubrimientos: “spputtering” de oro para obtener las mejores condiciones de imagen y, si se requiere microanálisis por rayor X, el recubrimiento por hilo de carbono.

Recubrimiento de muestras en alto vacío

Sus aplicaciones van más allá de la necesidad de obtener una muestra conductora para el SEM. Consigue recubrimientos de grano mucho más fino y está preparado para realizar “spputtering” con distintos metales. También trabaja por el método de evaporación, con lo que aumenta el rango de posibles elementos de recubrimiento. Utiliza electrodos de carbono para evaporarlo y obtener “films” que recubren las rejillas destinadas al TEM.

Observación de muestras criofijadas

El microscopio electrónico de barrido (SEM) puede dotarse de un sistema capaz de observar la muestra a muy baja temperatura de forma que su preservación estructural es máxima y la capacidad de trabajo del microscopio no se afecta en absoluto, pues ya no tratamos con una muestra hidratada sino congelada.

El proceso se inicia fuera del microscopio, enfriando la muestra a la máxima velocidad posible mediante nitrógeno nieve. A continuación ya pasa al sistema de criobservación, donde se puede fracturar, sublimar el hielo superficial y recubrir con oro o carbono para su observación y/o análisis. La ventaja de este sistema es que se puede observar cualquier muestra biológica o hidratada con una preparación mínima y rápida con una buena preservación estructural.

Como la imagen que se forma en el TEM depende de que los electrones puedan atravesar la muestra, ésta ha de ser suficientemente delgada para permitirlo. Todas las técnicas de preparación, tanto de muestras materiales como biológicas, persiguen el objetivo de adelgazar o conseguir secciones muy finas del espécimen, menores a 100 nm., afectando al mínimo su estructura original.

Preparación de muestras biológicas para el TEM

En general, la preparación de estas muestras siempre sigue el mismo protocolo básico: fijación química, lavado, deshidratación en series de concentraciones crecientes de alcohol o acetona, inclusión en resina y polimerización. Según el objetivo perseguido, en alguno de estos pasos se incluye una etapa de tinción con metales pesados, tales como el osmio, el wolframio o el uranio. En todo caso, este trabajo lo realiza el usuario en su laboratorio.

La siguiente etapa consiste en obtener cortes muy finos del material polimerizado. Para ello se utiliza un ultramicrotomo que sí está disponible en el Servicio.

Preparación de muestras de materiales en polvo para el TEM

En la preparación de este tipo de muestras sólo hay que diluir una cantidad muy pequeña de muestra en un disolvente orgánico que no la afecte, habitualmente dicloroetano o acetona. También se puede utilizar agua si no hay alternativa. A continuación se busca la máxima dispersión sumergiendo la solución en un baño de ultrasonidos y, al cabo de un tiempo, ya se puede depositar una gota sobre una rejilla filmada con carbono para ser observada directamente una vez se haya secado.

En el Servicio se provee al usuario de todo lo necesario en este proceso.

Preparación de muestras materiales compactas para el TEM

Para este tipo de muestras se sigue un proceso de adelgazamiento en el que es necesario la utilización de varios aparatos. En primer lugar el usuario ha de aportar una muestra que no supere las 200 µm. de grosor. A continuación, el primer paso es cortar un disco de 3 mm. de diámetro con el “Ultrasonic Disk Cutter” pues este es el tamaño de la muestra que se puede introducir en el TEM. El siguiente paso es excavar el disco por ambas caras hasta obtener una zona central de unas 20 µm. con el “Dimpling Grinder”. Una vez conseguido, se introduce este disco en el “Ion Milling” para que sea atacado por ambos lados con sendos haces de iones de argón hasta que estos realizan un pequeño orificio central, alrededor del cual queda una zona suficientemente delgada.

En el microscopio de fuerza atómica (AFM), una punta afilada situada en el extremo de una palanca flexible recorre la superficie de una muestra manteniendo constante una pequeña fuerza de interacción. El movimiento de barrido lo realiza un escaner piezo-eléctrico, y la interacción punta/muestra se monitoriza reflejando un láser en la parte trasera de la palanca, que se recoge en un detector fotodiodo. El fotodiodo esta dividido en 4 segmentos, y las diferencias de voltaje entre los distintos segmentos (generalmente los 2 superiores respecto de los 2 inferiores) determinan con precisión los cambios en la inclinación o amplitud de oscilación de la punta.

En el Servicio de Microscopía de la U.P.V. disponemos de los siguientes modos de trabajo:

AFM de Contacto: Mide la topografía deslizando la punta sobre la superficie de la muestra. Se puede realizar en aire y en medio líquido.

AFM de Tapping: Mide la topografía tocando intermitentemente la superficie de la muestra con una punta oscilante. Se eliminan las fuerzas laterales y de presión que pueden dañar las muestras blandas y reducir la resolución de la imagen. Se puede realizar en aire y en medio líquido.

Imagen de Fase: Proporciona imágenes cuyo contraste está causado por diferencias en las propiedades de adhesión y viscoelasticidad de la superficie de la muestra. Se realiza en modo Tapping y se mide como el retraso en la fase de oscilación de la punta medido en el fotodiodo, con respecto al valor de fase de oscilación proporcionado por el piezo del soporte de la punta.

Microscopia de Efecto Túnel: Mide la topografía de superficies conductoras utilizando una corriente de túnel que depende de la separación entre la punta y la superficie de la muestra.

Fuerzas Magnéticas: Mide el gradiente de distribución de fuerzas magnéticas por encima de la superficie de la muestra. Se lleva a cabo con el LiftMode para seguir la topografía de la muestra a una distancia fijada.

LiftMode: Se trata de una técnica combinada de dos pasos. Por una parte, mide de forma separada, y en modo Tapping, la topografía de la muestra. Por otra parte, mide otra propiedad seleccionada (fuerzas magnéticas, eléctricas, etc.) utilizando la información topográfica para mantener la punta por encima de la superficie de la muestra a una altura constante.

Fuerzas Laterales: Mide fuerzas de fricción entre la punta y la superficie de la muestra. En modo Contacto.

Medidas Fuerza-Distancia: Mide fuerzas repulsivas, de atracción y de adhesión entre punta y muestra durante el acercamiento, el contacto y la separación de ambas partes.

Fuerza Volumen: Realiza una serie de medidas puntuales de fueza-distancia sobre una área determinada de la muestra. Con esas curvas de fuerza individuales en cada punto, muestra imágenes de variaciones de fuerza y topografía de la muestra.

Electroquímica: Mide los cambios de la superficie y las propiedades de los materiales conductores sumergidos en soluciones electrolito, al establecer gradientes o ciclos de intensidad-voltage eléctrico.

DIGISTAR es la instrumentación que toma el control del sistema de iluminación y deflexión de un TEM para inclinar el haz de electrones hasta dos grados, al tiempo que lo hace rotar sobre un punto de la muestra. Como resultado, se reducen los efectos de difracción dinámica que ocurren en el TEM por efecto de la dispersión multiple, con lo que la intensidades de las reflexiones obtenidas pueden interpretarse como difracción cinemática. Esta técnica se denomina “Precesión” o PED (Precesión Electron Difraction).

La Precesión se puede aplicar en la adquisición de patrones de difracción de un cristal que se inclina manual o automáticamente una serie de grados (mínimo +/- 30º, separados por 1º). El software ADT3D (Automatic Difraction Tomography 3D) permite reconstruir el espacio recíproco para determinar la celda unidad y cuantificar las intensidades de las reflexiones medidas para obtener la estructura del cristal.

El ASTAR está formado por una CCD que adquiere los patrones de difracción generados en cualquier muestra cristalina bajo el haz de electrones de un TEM y por el software necesario para tratar esta información estructural. Dicho software compara los patrones de difracción medidos con todos los posibles dentro de la muestra, determinando tanto la distribución de las fases cristalinas presentes como la orientación de los granos que forman la muestra. Por ser esta información totalmente cuantitativa y recogida punto a punto, es posible saber con resolución nanométrica detalles de los bordes de grano, distribución de tamaño de grano, análisis de figuras de polo, etc.

El Servicio de Microscopía Electrónica dispone de un equipo adecuado para estudiar las propiedades mecánicas de muestras pequeñas, entre 1 y 4 cm. Este equipo permite realizar ensayos de tracción, compresión y flexión bajo las condiciones de dos células de carga a elegir: 150 N ó 2000 N.

Gracias a su reducido tamaño, la observación de estos ensayos se puede hacer en condiciones ambientales bajo una lupa, adquiriendo imágenes sucesivas o vídeo o también es posible realizarlos dentro de la cámara del microscopio electrónico de barrido, para su observación a elevados aumentos.

El microscopio electrónico de transmisión con 200 kV de aceleración está especialmente indicado para la nano-caracterización estructural y analítica de materiales pues dispone de un cañón de electrones de emisión de campo (FEG) que permite obtener haces muy intensos y de tamaño sub-nanométrico. Este equipo incorpora una lente objetivo de “Ultra Alta Resolución” que le confiere las siguientes capacidades:

Resolución	Punto a punto	0,19 nm.
	Entre líneas	0,1 nm.
Tamaño de spot	Modo TEM	2 – 5 nm.
	Modo EDS, NBD, CBD	0,5 – 2,4 nm.
	Modo STEM	0,2 nm.

Al portamuestras convencional con una inclinación de +/- 25º se le puede acoplar un soporte especial de alto ángulo (+/- 70º) para uso en tomografía. Además se puede utilizar un portamuestras de doble inclinación para estudios de difracción. El movimiento de la muestra depende de un goniómetro que incluye un mecanismo piezoeléctrico que permite el desplazamiento suave y la corrección de la deriva a grandes aumentos.

Dispone de una cámara CCD de alta resolución (2048 x 2048 pixels) de la marca GATAN, modelo SC200 para la obtención de imágenes y el software Digital Micrograph para su control de adquisición y procesado.

El microscopio está equipado con la unidad STEM y los detectores de imagen de campo claro y de campo oscuro de alto ángulo (HAADF), que facilita la observación de contraste de fases con distinto número atómico. La capacidad de caracterización química se completa con el detector de EDS X-Max 80 de Oxford Instruments, con una resolución de 127 eV y dotado para la ejecución de análisis elemental de áreas, puntuales y distribución espacial de los elementos en la muestra (mapping).

Finalmente, el microscopio incorpora la unidad DigiSTAR de Nanomegas para la adquisición de patrones de difracción en modo precesión y software ATD-3D (Nanomegas) para la reconstrucción automática del espacio 3D de los patrones de difracción. Esta herramienta es extremadamente importante para la caracterización de estructuras cristalinas en las investigaciones de ciencia de materiales.

El microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FESEM), es un instrumento que al igual que el SEM es capaz de ofrecer una amplia variedad de información procedente de la superficie de la muestra, pero con mayor resolución y con un rango de energía mucho mayor. El funcionamiento es igual al de un SEM convencional; se barre un haz de electrones sobre la superficie de la muestra mientras que en un monitor se visualiza la información que nos interesa en función de los detectores disponibles.

La mayor diferencia entre un FESEM y un SEM reside en el sistema generación de electrones. El FESEM utiliza como fuente de electrones un cañón de emisión de campo que proporciona haces de electrones de alta y baja energía muy focalizados, lo que mejora notablemente la resolución espacial y permite trabajar a muy bajos potenciales, (0.02 – 5 kV); esto ayuda a minimizar el efecto de carga en especímenes no conductores y a evitar daños en muestras sensibles al haz electrónico.

Otra característica muy destacable de los FESEM es la utilización de detectores dentro de la lente, (in lens). Estos detectores están optimizados para trabajar a alta resolución y muy bajo potencial de aceleración, por lo que son fundamentales para obtener el máximo rendimiento al equipo.

El equipo instalado en el Servicio de Microscopía de la U.P.V. es el modelo ULTRA 55 de la marca ZEISS y cuenta con los siguientes detectores de fabricación propia:

Detector de electrones secundarios SE2: ofrece la imagen SEM típica de la topografía de la superficie de la muestra con una gran profundidad de campo. Es el más adecuado para obtener resoluciones medias y bajas con potenciales de aceleración altos. Se utiliza principalmente para navegar por la muestra a bajos aumentos buscando puntos de interés y para estudiar muestras con mucha información topográfica.

Detector de electrones secundarios in lens: situado en el interior de la columna de electrones, trabaja con electrones secundarios de baja energía y ofrece las imágenes de mayor resolución. Es muy sensible a las características superficiales de la muestra, por lo que es muy adecuado para la caracterización superficial de cualquier material. Ofrece su mejor rendimiento a bajos potenciales de aceleración, (< 5 kV), por lo que es muy recomendable para trabajar con muestras sensibles al haz electrónico y para minimizar el efecto de carga en muestras no conductoras.

Detector de electrones retrodispersados AsB: es sensible a la variación de número atómico de los elementos presentes en la muestra, por lo que se utiliza para observar los cambios en la composición química del espécimen. El detector AsB cuenta con cuatro cuadrantes y permite seleccionar entre imagen con contraste topográfico y composicional. Además, gracias al modo de trabajo con alto ángulo, permite observar contraste estructural en muestras cristalinas.

Detector de electrones retrodispersados in lens EsB: es independiente del detector de secundarios in lens, lo que le permite ofrecer señal de retrodispersados pura, sin ninguna contaminación de electrones secundarios y a muy bajo potencial de aceleración. Proporciona más contraste en Z que ningún otro detector de retrodispersados, y es el único que puede seleccionar los electrones en función de su energía, lo que posibilita diferenciar elementos que se distinguen en solo unos pocos átomos. Además es capaz de trabajar a muy bajo voltaje (en el mismo rango que el detector in lens de secundarios), por lo que es ideal para muestras sensibles. El hecho de trabajar de manera independiente facilita captar la señal de electrones secundarios y retrodispersados de forma simultánea.

Detector de energía dispersiva de Rayos X, EDS (OXFORD INSTRUMENTS): recibe los Rayos X procedentes de cada uno de los puntos de la superficie sobre los que pasa el haz de electrones. Como la energía dispersada de los Rayos X es característica de cada elemento químico, proporciona información analítica cualitativa y cuantitativa de puntos, líneas o áreas seleccionadas en la superficie de la muestra. Esta técnica se conoce como Microanálisis por EDS.

El microscopio de doble haz integra las prestaciones de un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FESEM) con un microscopio de iones de Galio focalizados (FIB).

Un FIB tiene un grado de analogía muy alto con un SEM, sin embargo, en lugar de electrones utiliza un haz de iones de Ga⁺. Los iones de Ga⁺ son 130.000 veces más pesados que los electrones, por ello la interacción con el espécimen es significativamente más fuerte mientras que su nivel de penetración es menor. Así, los iones producen la rotura de los enlaces químicos y la ionización de los átomos del sustrato. Dado que el haz de iones se puede enfocar y controlar, este efecto se puede utilizar para modificar la estructura del espécimen a una escala nanométrica.

La ventaja de combinar ambas columnas, electrónica e iónica, en una misma plataforma estriba en que podemos obtener imágenes SEM de alta resolución al mismo tiempo que realizamos modificaciones en la muestra con el haz de iones.

Las aplicaciones típicas de este tipo de equipos son: realización de secciones transversales, preparación de muestras ultrafinas para TEM (“lamelas”), reconstrucción tridimensional del volumen de un espécimen y litografía electrónica e iónica.

Por otro lado, la parte FESEM es totalmente funcional de forma autónoma, de manera que cuando no se necesita usar la columna FIB, el equipo se puede utilizar como un FESEM convencional.

El equipo instalado en el Servicio de Microscopía de la U.P.V. es el modelo AURIGA Compact de la marca ZEISS y cuenta con los siguientes detectores de fabricación propia:

Detector de electrones secundarios SE2: ofrece la imagen SEM típica de la topografía de la superficie de la muestra con una gran profundidad de campo. Es el más adecuado para obtener resoluciones medias y bajas con potenciales de aceleración altos. Se utiliza principalmente para navegar por la muestra a bajos aumentos buscando puntos de interés y para estudiar muestras con mucha información topográfica.

Detector de electrones retrodispersados 4QBSD: es sensible a la variación de número atómico de los elementos presentes en la muestra, por lo que se utiliza para observar los cambios en la composición química del espécimen. Cuenta con cuatro cuadrantes y permite seleccionar entre imagen con contraste topográfico y composicional.

Detector combinado de electrones secundarios y retrodispersados in lens duo: situado en el interior de la columna de electrones. Tiene dos modos de trabajo:

1. Detector de electrones secundarios in lens: trabaja con electrones secundarios de baja energía y ofrece las imágenes de mayor resolución. Es muy sensible a las características superficiales de la muestra, por lo que es muy adecuado para la caracterización superficial de cualquier material. Ofrece su mejor rendimiento a bajos potenciales de aceleración, (< 5 kV), por lo que es muy recomendable para trabajar en muestras sensibles al haz electrónico y para minimizar el efecto de carga en muestras no conductoras.

2. Detector de electrones retrodispersados in lens EsB: permite obtener señal de retrodispersados pura a muy bajo potencial de aceleración. Proporciona un gran contraste Z y puede seleccionar los electrones en función su energía, lo que permite diferenciar elementos que se distinguen en solo unos pocos átomos. Además es capaz de trabajar a muy bajo voltaje, (en el mismo rango que el detector in lens de secundarios), por lo que es ideal para muestras sensibles.

Sistema de inyección de gases GIS (ORSAY PHYSICS): permite depositar Platino sobre la superficie de la muestra. El inyector introduce un precursor que se ioniza mediante el haz de iones de Galio y se adhiere a la superficie del espécimen de forma precisa.

Micromanipulador (KLEINDIEK): permite la extracción de las muestras TEM realizadas en el interior del equipo.

La unión de la capacidad óptica de un microscopio y la fuente de rayos X de un tomógrafo ofrece un equipo absolutamente innovador: sumamos la facultad de obtener imágenes de resolución submicrométrica de muestras relativamente grandes a la ventaja de ser ensayos no destructivos. Por lo tanto, la muestra no precisa ninguna preparación previa y al acabar el experimento puede ser reutilizada. Todas las técnicas microscópicas disponibles hasta ahora exigen un tratamiento previo de la muestra que siempre es destructivo, pues se requiere un tamaño muy pequeño de la parte a ser observada dentro del microscopio. Esto implica que la muestra no puede ser reutilizada en los procesos de fabricación, desarrollo, etc. en los que estaba implicada antes de su extracción para ser examinada.

El proceso de observación consiste en la irradiación de la muestra con un haz de rayos X y la toma sucesiva de imágenes de un volumen concreto de la muestra por la rotación de ésta en ángulos previamente fijados. El experimento se desarrolla en una cámara con condiciones ambientales y puede admitir una gran variedad de muestras procedentes de diferentes ámbitos de la investigación e industria, desde muestras orgánicas del campo de la biología y ciencias de la vida (vegetales, alimentos, insectos, …) hasta los materiales inorgánicos utilizados en aplicaciones de almacenamiento y conversión de energía, y las complejas estructuras (membranas, celdas electroquímicas) y sus dispositivos resultantes (baterías, pilas de combustible y electrolizadores…).

El volumen máximo sobre el que se puede obtener información es de 165 mm X 140 mm. y variará en función de la resolución final requerida. El grado de resolución dependerá́ del tipo de muestra, el objetivo utilizado, el volumen barrido y el tiempo dedicado, es decir, el número de rotaciones aplicado. Se puede iniciar el experimento escaneando un volumen grande a pocos aumentos y después acomodar las condiciones de objetivo y escaneos para tomar imágenes de diferentes volúmenes. El proceso acaba con la reconstrucción tridimensional de los barridos adquiridos para ofrecer una imagen final en 3D en la que se pueden realizar medidas tan precisas como la resolución final lo permita. En este equipo es de 500 nm.

El microscopio de rayos X incorpora diferentes técnicas de contraste (absorción, fases, etc.) de manera que se puede caracterizar el mayor rango de tipo de muestras. Asimismo, incluye los filtros y objetivos necesarios para poder trabajar en diferentes condiciones.

El objetivo fundamental que se ofrece con este equipo, integrado en el Servicio de Microscopia, es obtener imágenes 3D de alto contraste y resolución submicrométrica de muestras pertenecientes a numerosos campos científicos (Ciencias de los Materiales, Ingeniería y Electrónica, Ciencias de la Vida, Arqueología y Patrimonio Cultural, Fabricación Aditiva, Industria Cerámica, etc.), de objetos de grandes dimensiones. Las reconstrucciones 3D de los mismos permitirán entre otras: cuantificación de defectos, organización de fases en materiales composites, estudios de permeabilidad, conectividad y porosidad, análisis de microestructuras, etc.